TROMBOFILIA

I. TROMBOZA - FACTORI DE RISC

Având o frecvență de 2 - 7% în populația generală, forma heterozigotă a mutației Leiden a factorului V este unul din polimorfismele genetice cu cea mai mare importanță clinică. Femeile heterozigote care folosesc pilula contraceptivă cresc de 30 de ori riscul tromboembolic, iar cele homozigote de 200 de ori. De aceea, se recomandă ca rezistența APC sa fie determinată împreună cu diverși factori anticoagulanți, iar dacă se descoperă o scădere a acesteia, atunci diagnosticul trebuie completat cu analiza mutațiilor factorului V. Pacientele trebuie să cunoască riscul ereditar pentru tromboze.

Tromboza venoasă profundă și complicațiile acesteia reprezintă situații patologice acute dintre cele mai frecvente. Incidența anuală medie a trombozelor venoase este de 0.1% în populația generală, dar ea crește semnificativ pentru grupele de vârsta mai înaintate. Un număr mare de factori variabili pot crește riscul. Profilaxia cu heparină fracționată este larg utilizată în situațiile acute în care riscul trombozelor este extrem de crescut, de pilda postoperator sau posttraumatic. In afară de aceste situații în care riscul este temporar, există factori genetici și biochimici care actionează cronic și care sunt grupați sub denumirea de trombofilie.

Care sunt parametrii de laborator ce trebuie investigați în evaluarea unei trombofilii?

Primul grup se referă la deficiențele factorilor anticoagulanți naturali, proteina S, proteina C și antitrombina III. Scăderea activității acestora favorizează trombogeneza. Având o frecvență de 0.2 - 5 / 1000 indivizi, aceste forme ereditare de trombofilie apar foarte rar și sunt răspunzatoare doar de 1 - 3% din cazurile de tromboză. Mutațiile “activatoare de funcție” ale factorului V și protrombinei sunt mult mai frecvent implicate.

Mutatia V Leiden are drept efect rezistența factorului V la clivajul proteolitic exercitat de proteina C activată (APC). Rezistența la APC duce la scăderea inhibării cascadei de coagulare, cu creșterea consecutivă a riscului de tromboză. Mutația G20210A a protrombinei duce la hiper-protrombinemie, deci la exces de factor de coagulare trombogenic.

În afară de factorii ereditari de trombofilie, mai există și factori dobândiți, cum ar fi sindromul antifosfolipidic (APL). Dacă fosfolipidele, cardiolipina sau fosfatidilserina sunt prezente, anticorpii antifosfolipidici se leagă de anumite proteine plasmatice, cum ar fi beta-2-glicoproteina. Se pare că mecanismele patogenice prin care anticorpii APL au efect protrombotic sunt multiple. De exemplu, se cunoaște faptul că Ac APL cresc expresia factorului tisular, inhibă fibrinoliza și interferă cu sistemul proteinei C. În plus, unii Ac APL determină in vitro un efect cunoscut sub numele de anticoagulant lupic. Anticorpii APL determină prelungirea timpilor de coagulare fosfolipid-dependenți, cum ar fi APTT. Depistarea sindromului APL se bazează, în diagnosticul de laborator, fie pe detectarea anticoagulantului lupic, fie pe depistarea anticorpilor anti-cardiolipină sau anti-beta-2-glicoproteină. La interpretarea rezultatelor, se va ține cont de faptul că anticorpii APL pot apărea, tranzitor, în cursul infecțiilor și, uneori, pot fi prezenți la indivizii sănătoși.

Un alt factor trombofilic este hiper-homocisteinemia

 

Prevalența

Prevalența la cei

Risc relativ de

Risc relativ de

 

generală

cu tromboza

apariție a

tromboze

 

 

 

trombozei

recurente

 

 

 

 

 

Mutații cu “scăderea funcției”

 

 

 

 

 

 

 

 

Deficit de Antitrombina III

< 1%

1%

10 - 25

1,5 - 3

 

 

 

 

 

Deficit de Proteina S

< 1%

3%

8 - 10

1,5 - 3

 

 

 

 

 

Deficit de Proteina C

< 1%

3%

7 - 10

1,5 - 3

 

 

 

 

 

Mutații cu “creșterea funcției”

 

 

 

 

 

 

 

 

Mutația V Leiden

5 - 8%

12 - 30%

5 - 7

1 - 2

heterozigot

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Mutația G20210A a

1 - 4%

7 - 18%

2 - 3

1 - 2

protrombinei

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Factori de risc dobândiți

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Anticoagulant lupic / APL

 

5 - 20%

10

2 - 4

 

 

 

 

 

Hiperhomocisteinemia

5 - 10%

10 - 25%

2 - 3

1 - 3

 

 

 

 

 

Riscul crescut de tromboze se datorează mutațiilor mai rare

Deficiențele rare ale anticoagulanților naturali (proteina S, proteina C și antitrombina III) se asociază cu un risc de 10 - 20 de ori mai mare pentru o primo-tromboză față de indivizii sănătoși, comparativ cu mutațiile mult mai frecvente ale factorilor pro-coagulanți (Factor V Leiden și protrombina C20210A), care determină creșteri moderate ale riscului de tromboză. În cazul factorilor dobândiți, prezența anticorpilor APL duce la o creștere semnificativă a riscului și, spre deosebire de factorii ereditari, anticorpii APL determină și tromboze arteriale.

Terapia anticoagulantă se recomandă atunci când factorii de risc se sumeaza

Dacă testarea pentru trombofilie se face în cadrul unui screening la o persoana fară date anamnestice de tromboză, chiar dacă testele arată un risc relativ crescut, riscul absolut de tromboză trebuie considerat doar ușor sau moderat, iar terapia anticoagulantă, cu toate riscurile sale de accidente hemoragice, este complet nejustificată. Dacă se cunoaște însă o predispoziție trombotică, atunci trebuie luate în considerare măsuri profilactice pentru situațiile cu risc, cum ar fi operații sau imobilizări. În plus, atunci când factorii de risc trombofilici sunt prezenți, decizia de a prescrie contraceptive orale trebuie atent cântărită. Per se, contraceptivele orale determină un risc crescut de 2 - 3 ori de a face tromboză, dar riscul crește de 30 de ori atunci când este prezent factorul V Leiden.

Motivul principal pentru care testăm factorii de risc trombofilici este acela de a determina dacă este necesară terapia cu anticoagulante după un episod trombotic. Decizia este mai usor de luat atunci când factorii de risc prezenți se asociază cu risc crescut de recurență. În general, se recomandă ca diagnosticul trombofiliei să nu se facă imediat după episodul trombotic, ci după încheierea terapiei anticoagulante inițiale (șase luni). De asemenea, se recomandă ca diagnosticul să cuprindă toti parametrii prezenți în tabel, deoarece în cazul unei suprapuneri de factori, riscul este semnificativ mai mare, iar factorii care prezintă un risc singular mic pot deveni relevanți.

II. METILENTETRAHIDROFOLAT REDUCTAZA ȘI RISCUL DE TROMBOZĂ

Enzima metilentetrahidrofolat reductaza (MTHFR) joacă un rol important în metabolismul folaților, iar activitatea sa este indirect proporțională cu nivelul plasmatic al homocisteinei. O activitate enzimatică redusă determină astfel hiperhomocisteinemie. Cauza acestei deficiențe enzimatice pare a fi o mutație a genei MTHFR. Prevalența mutației în forma heterozigotă este 40%, iar în forma homozigota, 4-16%. Probabilitatea apariției hiperhomocisteinemiei este mai mare în cazul în care există un polimorfism al genei MTHFR.

Mutațiile

Cea mai frecventă mutație din gena MTHFR este o mutație punctiformă în codonul 677 (677 C-T). La homozigoți, aceasta se traduce printr-o formă termic instabilă, care reduce activitatea enzimei cu 50%. A doua mutație în gena MTHFR, care apare cu aproape aceeași frecvența, este în codonul 298 (298 C-A1), iar homozigoții vor avea o scădere cu aproximativ 60% a activității enzimei. Se pare că mutația din poziția 298 C-A1 în forma homozigotă sau heterozigotă duce la creșterea homocisteinemiei numai dacă se asociază cu o mutație în poziția 677, homozigotă sau heterozigotă. O combinație homozigot 677 C-T si heterozigot 298 C-A1 este foarte rară, iar combinația homozigot pentru ambele mutații nu poate fi întâlnită.

Activitatea enzimatică și efectele ei

În timpul metabolizării, sunt necesare 4 forme activate de acid folic, care se găsesc într-un echilibru menținut prin reacții de oxidare și reducere. Două dintre acestea sunt 5,10-metilentetrahidrofolatul si 5- metiltetrahidrofolatul.

MTHFR catalizează reducerea 5,10-metilentetrahidrofolatului la 5-metiltetrahidrofolat. Metiltetrahidrofolatul, ca si metilcobalamina, este necesar pentru conversia homocisteinei în aminoacidul esențial metionina. Dacă activitatea MTHFR este scăzută, atunci homocisteina se poate acumula în plasmă. Indivizii heterozigoți purtători ai ambelor mutații reprezintă aproximativ 15% din populație. Comparativ cu restul indivizilor (85%), ei vor avea o scădere cu 50-60% a activității enzimei, adica mai mult decât heterozigoții pentru o singură mutație 677 C-T. Homozigotismul pentru ambele mutații (677 C-T si 298 C-A1) pare a fi fatal, deoarece nu a putut fi observat.

Mutațiile MTHFR și concentrația homocisteinei în plasmă

La pacienții homozigoți, se observă creșteri variind între ușoare și moderate ale nivelului plasmatic al homocisteinei, în special la cei cu nivel scăzut de acid folic. La purtătorii heterozigoți, homocisteinemia rămâne în intervalul de referință, cu condiția să nu existe o deficiență de folat și B12 asociată. Această interacțiune între genetică și nutriție este probabil legătura cu un risc crescut pentru boli cardiovasculare și pentru defecte de tub neural. De aceea, este recomandat ca femeile care vor să aibă copii să ia un supliment de 5 mg de acid folic pe zi încă înainte de sarcină. Același lucru se recomandă femeilor însărcinate care au risc de a avea un copil cu defecte de tub neural. Această doză trebuie administrată dinainte de concepție și pâna la sfârșitul primului trimestru.

Se pare că riscul apariției trombozei este și mai mare atunci când, pe lângă mutațiile MTHFR, există și un Factor 5 Leiden sau o mutație 20210 în gena protrombinei. Aceste polimorfisme sunt cu siguranță cauza avorturilor spontane repetate, la vârstă mică a sarcinii.

În plus, se pare (inhibitor competitiv al sintetazei).

Analiza mutațiilor genei MTHFR este recomandată în următoarele situații:

  • Risc crescut pentru tromboze sau ateroscleroză
  • Risc familial pentru boli coronariene
  • Defect de tub neural fetal în familie
  • Avorturi spontane repetate în primele saptămâni de sarcină

Ca factor de risc, mutația MTHFR este independentă de hipertensiune, hiperlipemie sau alți factori, precum fumatul. Dieta și suplimentarea cu acid folic pot determina temporar nivele plasmatice fiziologice de homocisteină la pacienții cu predispoziție genetică.

Metoda de analiză

După izolarea ADN-ului genomic din sângele venos periferic, se cercetează prezența mutației prin real-time PCR, folosind tehnologia LightCycler.

III. DIAGNOSTICUL SINDROMULUI ANTIFOSFOLIPIDIC

Majoritatea anticorpilor antifosfolipidici sunt dirijați nu împotriva fosfolipidelor, ci împotriva proteinelor asociate fosfolipidelor, cum ar fi protrombina. Din acest motiv, sunt necesare criterii complexe de diagnostic de laborator.

Trombozele vasculare sunt criteriul clinic pentru diagnosticul APS.

Sindromul antifosfolipidic (APS) reprezintă o cauză importantă pentru trombofilia dobândită și pentru avorturile recurente. În 1999, International Society of Thrombosis and Hemostasis (ISTH) a definit pentru prima oara, într-o forma general acceptată, definiția și criteriile clinice și de laborator pentru diagnosticul APS. Potrivit acestui acord, revizuit în 2006, criteriile clinice sunt:

  • Tromboze vasculare
  • Avorturi spontane recurente înainte de săptămâna 10 de sarcină (cel puțin 3)
  • Avorturi spontane neexplicate după săptămâna 10 de sarcină
  • Avorturi spontane datorate preeclampsiei sau insuficienței placentare.

În afara acestor criterii clinice, diagnosticul APS mai presupune și prezența anticorpilor antifosfolipidici. Acest lucru se face prin detectarea anticoagulantului lupic sau a anticorpilor anti-cardiolipinici si anti β2-glicoproteina I în titruri medii și mari. Un rezultat pozitiv trebuie confirmat dupa minimum 12 săptămâni, deoarece trebuie excluse formele tranzitorii de anticorpi antifosfolipidici care apar uneori în infecții, dar nu se asociază cu un sindrom antifosfolipidic. În cele ce urmează, ne vom referi la câteva aspecte relevante pentru diagnosticul APS , inclusiv criteriile de laborator.

Identificarea directă a anticorpilor

Termenul de “anticorp antifosfolipidic” poate fi ambiguu, deoarece clasificarea inițială a acestor anticorpi nu a avut în vedere specificitatea antigenică cunoscută în prezent, ci metoda de verificare. În mod tradițional, erau folosite două tipuri de teste: testul anticoagulantului lupic și testul ELISA de identificare a anticorpilor anti-cardiolipinici. Anticoagulantul lupic reunește anticorpi care prelungesc timpii de coagulare fosfolipid – dependenți. Anticorpii anti-cardiolipinici identificați imunoenzimatic (ELISA) au drept antigen ținta cardiolipina fosfolipidică anionică.

În anii ’90, au fost detectate antigenele specifice ale anticoagulantului lupic și al anticorpilor anti-cardiolipinici și s-a constatat că majoritatea anticorpilor anti-fosfolipidici sunt dirijați nu împotriva fosfolipidelor, ci a proteinelor asociate fosfolipidelor. Cel mai bine au fost caracterizate β2 glicoproteina I (β2GPI) și protrombina. Ca urmare a acestor descoperiri, s-au dezvoltat teste ELISA directe pentru identificarea acestor anticorpi, în special testele pentru anticorpii anti-β2GPI, deoarece s-a constatat că au semnificație clinică importantă, fiind asociați cu un risc înalt de tromboză.

Metode de identificare a anticoagulantului lupic

Deoarece nu există un test specific, identificarea anticoagulantului lupic presupune mai multe etape:

  1. Screening prin teste de coagulare fosfolipid-dependente. Deoarece niciunul nu este complet acoperitor pentru toate tipurile de anticorpi anticoagulant lupic, se recomandă să se verifice prin două teste, dar primul este negativ. Numai dacă ambele teste sunt negative, se poate exclude cu toată probabilitatea prezența anticoagulantului lupic. Unul dintre teste trebuie să fie timpul de reptilază sau timpul cu venin de vipera diluat Russell (dRVVT), iar celălalt trebuie sa fie un APTT lupus sensibil.
  2. Teste de confirmare, care se fac dacă screening-ul arată un rezultat pozitiv. Se confirmă prezența unui inhibitor și fosfolipid-dependența acestuia prin adăugarea, în efectuarea testului de coagulare pozitiv, a unei plasme umane normale și a fosfolipidelor.